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菌株的保藏方法

更新時間:2015-07-07點擊次數(shù):1466

菌株的保藏方法

1.載體保存法:即將微生物吸附在適當載體上進行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種,如

① 土壤保存法:主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液,立即在室溫下進行干燥或使菌體繁殖后再干燥,然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜,土壤需風干、粉碎、過篩和滅菌。

使微生物在土壤中繁殖后進行干燥保存的方法是:取適量土壤(5克)置于塞有棉塞的試管中,加水或加入充分稀釋的液體培養(yǎng)基(以含水量為土壤大持水量的60%為宜),然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進行大量接種,培養(yǎng)至菌絲能用肉眼確認的程度為止,移入干燥器中經(jīng)短時間干燥或風干后密封,冷藏或室溫保存。

② 砂土保存法:取清潔的砂,過60目篩去掉大砂粒,并用磁鐵吸去砂中鐵屑,再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替清洗數(shù)次,干燥后,置于試管或安瓶管中保持2~3cm深,再經(jīng)干熱滅菌后,加入1ml菌種培養(yǎng)液,經(jīng)充分混勻后,放入真空干燥器中,*干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂(經(jīng)HCl預處理)和一份貧瘠、過篩的黃土攙和后滅菌,再進行菌種保藏。

③ 硅膠保存法:以6~16目的無色硅膠代替砂子,干熱滅菌后,加入菌液。加菌液時,由于硅膠的吸附熱常使溫度升高,因而需設法加以冷卻。

④ 磁珠保存法:將菌液浸入素燒磁珠(或多孔玻璃珠)后再進行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠(或無水CaSO4),上鋪玻璃棉,再放上10~20粒磁珠,經(jīng)干熱滅菌后,接入菌懸液,后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對酵母菌很有效,特別適用于根瘤菌,可保存長達兩年半時間。

⑤ 麩皮保存法:在麩皮內(nèi)加入60%的水,經(jīng)滅菌后接種培養(yǎng),后干燥保藏。

⑥ 紙片(濾紙)保存法:將滅菌紙片浸入培養(yǎng)液或菌懸液中,常壓或減壓干燥后,置于裝有干燥劑的容器內(nèi)進行保存。

2.

冷凍保存法:適用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外遭受凍結(jié)的情況下而不受損傷,而對其它大多數(shù)微生物而言,無論在細胞外凍結(jié)還是在細胞內(nèi)凍結(jié),都會對菌體造成損傷,因此當采用這種保藏方法時,應注意以下幾點,

① 要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞;

② 要選擇適宜的培養(yǎng)基,因為某些微生物對冷凍的抵抗力,常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異;

③ 要選擇合適的菌液濃度,通常菌液濃度越高,生存率越高,保存期也越長;

④ 在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)(如食鹽等);

⑤ 可在菌液內(nèi)添加甘油等保護劑,以防止在冷凍過程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣,也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑,但對有些微生物而言,不加保護劑時更有效。

⑥ 原則上應盡快進行冷凍處理,但當加入保護劑時,可靜置一段時間后再進行處理。

⑦ 就動物細胞而言,應在-20℃范圍內(nèi)以1℃/min左右的速度緩慢降溫,此后必須盡快降到貯藏溫度;而對絕大多數(shù)微生物而言,則不必如此,如結(jié)構(gòu)較為復雜的原蟲則可在-35℃范圍內(nèi)進行緩慢降溫,而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍;

⑧ 若進行長期保存,則貯藏溫度越低越好;

⑨ 取用冷凍保存的菌種時,應采取速融措施,即在35~40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說,則應選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化后,應盡量避免再次冷凍,否則菌體的存活率將顯著下降。

3.傳代保存法:有些微生物當遇到冷凍或干燥等處理時,會很快死亡,因此在這種情況下,只能求助于傳代培養(yǎng)保存法。傳代培養(yǎng)就是要定期地進行菌種轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)后再保存,它是基本的微生物保存法,例如酸奶等常用生產(chǎn)菌種的保存。

傳代保存時,培養(yǎng)基的濃度不宜過高,營養(yǎng)成分不宜過于豐富,尤其是碳水化合物的濃度應在可能的范圍內(nèi)盡量降低。培養(yǎng)溫度通常以稍低于適生長溫度為好。若為產(chǎn)酸菌種,則應在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣。

一般地,大多數(shù)菌種的保藏溫度以5℃為好,像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進行保存,而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。

傳代培養(yǎng)保存法雖然簡便,但其缺點也很明顯,如:①菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)霉;②菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異;③反復傳代時,菌株的病原性、形成生理活性物質(zhì)的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期轉(zhuǎn)種,工作量大;⑤雜菌的污染機會較多。          

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